Az elmúlt években a klímaváltozás jelei már mindenki számára észrevehetővé váltak, hiszen egyre több szélsőséges időjárási esemény volt megfigyelhető az elmúlt években. Az aszályos nyár a növények termőképességét is csökkenti, hiszen nem képesek elmenekülni a meleg elől, csak túl tudják valahogyan élni. A növények ilyenkor stresszt élnek át, hiszen megváltoztak az életkörülményeik, aminek a hatására különböző anyagok termelésébe kezdenek, azaz megváltoztatják az „ujjlenyomatukat”.
A növények „ujjlenyomatát” nem úgy kell érteni, mint az emberét, hiszen sem kezük, sem ujjuk nincsen. A növények ujjlenyomata azon mérhető komponensek pillanatszerű meghatározása, amelyeket a sejtszintű, specifikus folyamatok által termelnek. Magyarán a bennük zajló folyamatok által előállított és lebontott anyagok összessége: azaz a növények ujjlenyomata alatt metabolitjaik összességét értjük. A metabolom egy biológiai mintában vagy élőlényben megtalálható kismolekulás metabolitok, anyagcseretermékek összessége. Méretben a peptidek (30-50 aminosavból álló egység) nagyságrendje alatti molekulákat értjük kismolekulák alatt, maximum 1 kDa nagyságig, ezek többnyire az anyagcsere köztes termékei; cukrok, hormonok, szignál- (más szóval jelző-) molekulák, másodlagos anyagcseretermékek. A metabolom folyton változó, dinamikus egyensúlyban van, tehát a mérés során egy pillanatnyi állapotot figyelhetünk meg. A növények esetében további csoportosítása is van a metabolomnak, azaz a növekedésben közvetlen szerepet játszó komponenseket elsődleges metabolomoknak nevezzük, a másodlagos pedig minden más mérhető komponens. Fontos továbbá, hogy az anyagcseretermékek koncentrációváltozása nem független egymástól, hiszen egymásból alakulhatnak át. A metabolom nagyságrendileg több ezer különböző komponens is lehet.
Betegségek nyomában
Manapság már szinte magától értetődőnek számít, hogy ha valami egészségügyi panaszunk van, akkor az orvos elküld bennünket vér- és vizeletvizsgálatra, majd az eredményeket kiértékelve megállapítja, hogy mi is a probléma oka. De ez nem volt mindig így! A legközismertebb példa erre a cukorbetegség megállapítása. Kínában Kr. e. 2000-1500 években már felfedezték, hogy a cukorbetegek vizelete édes a benne levő cukor miatt. De mindenkinek más az ízlése, hogy ki mit érez édesnek, ezért igyekeztek egzaktabbá tenni a mérés módját. Erre hangyákat használtak, mert azokat a cukortartalmú vizelet jobban vonzotta, mint a cukrot nem tartalmazó kontroll. A 3. dinasztia idejében (Kr. e. 1500-as évek) Egyiptomban is ugyanezt a módszert alkalmazták a diabétesz diagnosztizálására. Európában még sokáig ízleléssel határozták meg a cukorbetegséget. Az érzékszervi vizsgálatokat manapság is alkalmazzák (például az ivóvíz vizsgálatánál) akkreditált laboratóriumokban.
Az analitikai eljárások azóta sokat fejlődtek, de ma is az a cél, hogy a mintában található komponenseket mérhetővé tehessük, minél kisebb mennyiségben minél jobban lássuk. Ehhez a műszeres analitika nyújt segítséget, mellyel kis mennyiségeket is képesek vagyunk kimutatni, vagyis a növény metabolomjában bekövetkező legkisebb változásokat is követni tudjuk.
A növények vizsgálata nagyon sokrétű, hiszen nem tudják elkerülni a rájuk veszélyes környezeti (UV, savas eső, hideg, meleg) és biotikus (kórokozó) hatásokat, így más módot kell találniuk a túlélésre melynek a kulcsa a tolerancia kialakítása és az akklimáció. A növények ilyen vizsgálatával a növényi stresszélettan foglalkozik. Helyhez kötött életmódjukból adódóan a növények a környezeti változásokra elsősorban metabolitjaik megváltoztatásával tudnak reagálni. Ebből adódóan a növényekben igen nagyszámú, mintegy 200 ezer anyagcsereterméket írtak le. Minden hatásnak, ami a növényeket éri, van egy a növény metabolomjára gyakorolt effektusa, ami eltolja annak dinamikus egyensúlyát. Vagyis a növény stressz hatására változtatja az „ujjlenyomatát”. Ennek monitorozására nagyműszeres analitikai eszközöket használnak, mivel sem a kvantitatív (mennyiségi) sem a kvalitatív (minőségi) változásokat nem lehet előre jelezni, így minden mérhető komponenst meg kell tudni vizsgálni.
Hogyan tudjuk mérni?
Kezdetben papírkromatográfiával tették mérhetővé a metabolomot, olyan módon, hogy a minta tisztítása után egy papírra (álló fázis) cseppentették a minta adott mennyiségét, majd egy folyadékba (több oldószer elegye, szakszóval mobil fázis) lógatva annak alsó részét, hagyták, hogy a papíron a folyadékban kialakuló megoszlási egyensúlyok alapján fusson a lap
felső részéig a mobil fázissal telített gőztérben. Amikor végigfutott, egy előhívószerrel előhívták. A papír, mivel cellulózból készült, a poláros vegyületeket jobban megköti, az apoláris komponenseket viszont messzebbre engedi vándorolni. Ez az elválasztás azonban nagy mennyiségű komponens esetében nem túl jó.
Ahogy a technika fejlődött, úgy jelentek meg más mobil fázis (gáz) és állófázisok is. Manapság többnyire gázkromatográfiával (GC) és folyadékkromatográfiával (LC) vizsgálják a metabolomot, tömegspektrométer (MS) detektorral, valamint időnként mágneses magrezonancia spektroszkópiával (NMR) kombinálva.
Martonvásáron az Agrártudományi Kutatóközpont Mezőgazdasági Intézetében a Növényélettani Osztály kutatói egy különleges metabolomika labort építettek ki az elmúlt években a GINOP-2.3.-15-2016-00018 projekt (címe: Metabolomikai platform létrehozása a mezőgazdasági kutatások támogatása érdekében) támogatásával, hogy ott a növények metabolomát részletesen és színvonalasan lehessen vizsgálni. A műszerezettség lehetővé teszi, hogy minden illékony vagy illékonnyá tehető, valamint kevésbé illékony, nagyobb anyagcseretermékeket is vizsgálni lehet, ezzel lefedve a növényekben levő komponensek széles palettáját. A metabolomikai platformon 2-2 nagyműszer működik, egy gázkromatográf és egy folyadékkromatográf tandem kvadrupol tömegspektrométerrel a pontos mennyiségi meghatározásokhoz, valamint egy két termosztátos gázkromatográf repülési idő (time-offlight – TOF, melynek neve Pegazus, és egyetlen az országban) és egy folyadékkromatográf ionmobilitásos kvadrupol TOF (IMS-QTOF) detektorral az ismeretlen komponensek azonosításához.
Az illékony és illékonnyá tehető komponenseket GC-n lehet vizsgálni. A GC olyan elválasztási módszer, mely esetben a mobil fázis gáz (például hélium), az álló fázis pedig egy nagyon vékony cső, szakszóval kapilláris kolonna (továbbiakban: oszlop), melynek belső falán egy vékony filmréteg van. Ez lehet poláris vagy apoláris, hogy a minta komponenseit minél jobban el tudja választani. Az elválasztás a termostabilis, magyarán hőre nem bomló komponensek forráspontja alapján történik. A minta injektálása után azt elpárologtatva az oszlopra jutnak a komponensek, melyet hőprogram alapján fűtenek fel folyamatos gázáramlás mellett. Az így kialakult forráspontkülönbségek alapján válnak el az anyagcseretermékek egymástól, és lesznek detektálhatók, mérhetők. Az adja a martonvásári GC különlegességét, hogy nem 1, hanem 2 oszlopon halad keresztül a minta, a második boszlop az első után sorosan van kötve, köztük pedig egy modulátor rész található. A modulátor nagyon rövid idő alatt lehűti, és újra felmelegíti a már elválasztódott komponenseket, és így újrainjektálja a második oszlopra, ahol egy más típusú kolonnán újabb elválasztást tesz lehetővé. A két oszlopon modulálva végighaladó minták úgynevezett 2 dimenziós (2D) kromatogramot adnak, ahol is a retenciós idők a 2. oszlopon elválasztódott minták intenzitásával függenek össze. Az egy oszlopon elválasztott minták kromatogramja akármilyen jó matematikai hátterű programmal kiértékelve sem tudnak olyan teljes képet adni, mint egy 2D kromatogram. Így a mintában fellelhető minden illékony és illékonnyá tehető hőstabilis vegyületet be lehet azonosítani. A metabolomika esetében többnyire nem célzott komponensnek a vizsgálata zajlik, hiszen a legtöbb esetben nem tudjuk előre, hogy mi lesz az a célmolekula, amelyik a kezelés hatására változik. Ha tudnánk, könnyebb dolgunk lenne. Egy kromatográfiás futásból akár több száz komponenst is meg lehet határozni. Ezt a nagy mennyiségű adathalmazt a megfelelő matematikai módszerekkel is ki kell értékelni, nemcsak kromatográfus szemmel.
Ha fel szeretnénk ölelni a metabolomitok széles palettáját, akkor a nem illékony komponensek vagy hőlabilis komponensek vizsgálata is fontos, mely LC-vel történik. Az LC olyan elválasztási módszer, mely esetben folyadékelegy a mobil fázis, az álló fázis pedig egy töltetes kolonna, mely szintén lelassítja a rajta áthaladó folyadék által hajtott komponenseket, melyek elválasztása a mobil fázis összetételén és az állófázis minőségén múlik. Ebben az esetben a mozgó fázis összetétele és annak időbeli koncentrációváltozása adja a komponensek elválasztását, amit a Q-TOF detektál.
Az álló fázisok polaritása alapján kétféle folyadékkromatográfia létezik: a normál fázisú és a fordított fázisú. A normál fázisú volt az első, amit használtak, emiatt nevezik így. Ez azt jelenti, hogy az álló fázis poláris, a mozgó fázis pedig apoláris, így polaritás alapján választódnak el a mérendő komponensek. Mivel a poláris komponens jobban kötődik a poláris állófázishoz, később detektálható, mint az apoláris molekula, amelyik akadálytalanul végighalad az elválasztórendszeren. A fordított fázis pedig ennek a fordítottja, vagyis az állófázis apoláris a mozgó fázis pedig poláris. A fordított fázisú kolonnák kevésbé sérülékenyek, mint a normál fázisúak, így jobban elterjedtek.
A metabolomikai mérések szempontjából fontosak továbbá az ioncserés kolonnák is, melyeknél az elválasztás az állófázishoz kötött, töltéssel rendelkező helyek és a mérendő ionok kölcsönhatásán alapul. Létezik kation- és anioncserélő oszlop is. Maga az ioncserés kromatográfia a szénhidrátok és oligocukor-mérések esetében különösen elterjedt. A műszerben egy ionmobilitás cella is van, ami az ionok mérete, töltése és alakja alapján ad egy plusz elválasztást, ezzel is segítve a nem célzott analízist, megkönnyítve a komponensek beazonosítását.
A másik GC és LC, mely tandem MS-sel detektál, olyan kialakítású műszer, melyben egy kolonna van, de két MS detektor, közöttük pedig egy ütközési cella található. Ezeknek a kialakítása olyan, hogy nagyon kis mennyiségű, ismert komponenst lehessen nagy pontossággal mérni, vagyis ha a Q-TOF mérések alapján tudható, hogy mi változott, akkor ezeken pontosan mérhető a komponensek femtogramm szintű változása is. Az MS detektornak van olyan mérési lehetősége is, mely során szelektíven kiválasztott tömegszámot detektál. Ezzel a módszerrel nagyon nagy pontossággal és biztonsággal meg lehet állapítani az adott ismert anyag mennyiségét. A tandem MS esetében az elsődleges MS is szelektív módon detektál, majd az ütközési cellába érve a kiválasztott molekula egy inert gázzal (nitrogén) ütközve széttöredezik (fragmentálódik), a második detektort pedig egy fragmensre szintén szelektív módban működtetve, csak és kizárólag az adott fragmenst fogja detektálni. Így nagyon kis mennyiségű változás is monitorozható.
Mire jó mindez?
A növények túlélésének kulcsa a tolerancia kialakítása. A kérdés így adja magát: mi is változott a stressz hatására a növényben, és mi változott a stressztolerancia kialakulása után? Ezt a rendkívül izgalmas kérdést tette fel már számos kutató, hiszen a klímaváltozás miatt éghajlatunk átalakul. Vannak olyan, a mezőgazdaságban fontos növények, melyek jobban tűrik ezt a változást, és vannak, melyek kevésbé. Igyekezni kell a kevésbé jól tűrő növényt segíteni, hogy akár egy kezeléssel, például egy permetezéssel ellenállóbb legyen. Többek közt ennek az ellenállóságnak a molekuláris szintű hátterét lehet mérhetővé tenni ezekkel a műszerekkel.
Az közismert, hogy a krumpli tárolásakor oda kell figyelni, hogy 2-3 °C alá ne csökkenjen a levegő hőmérséklete, mert akkor a krumpliban levő keményítő átalakul cukorrá, és édes lesz a burgonya. De vajon milyen metabolomikai változásokat indít be még a hideg? És vajon csak a gumójában indulnak el ezek a változások vagy a növény egészét nézve mérhetők? Ilyen kérdésekre adhat választ a metabolomika. Hideg hatására a növények elsődlegesen a krioprotektáns (olyan vegyületek, melyek megvédik a növényt a fagyás hatásaitól) anyagokat halmoznak fel, vagyis eltolják a metabolom dinamikus egyensúlyát, hogy megvédjék magukat. Fagy esetén a növények számára az intracelluláris jégképződés jelenti a legnagyobb veszélyt, így azt igyekeznek megakadályozni. Ennek két módja van, az egyik a túlhűlés, mely során a növény a sejtjeiben akkumulálja az ozmotikusan aktív anyagokat (például cukrok, polialkoholok), hogy ne tudjon jégkristály képződni a citoplazmában, a másik út pedig a víz elszállítása az érzékenyebb szövettájból a kevésbé érzékenyek felé. Ezt az egyensúlyban bekövetkező változást nyomon lehet követni a metabolomitok mérésével. Az egyszerű cukrok (mono-, di- és tri-szaharidok) mérhetők GC-n, mert illékonnyá tehetők. Így olyan új információkhoz lehet jutni, melyet nem lehetett előre megjósolni, de mégis további izgalmas, új kutatási irányokra ad lehetőségeket.
Összegezve, a metabolomika olyan kismolekulák mérését jelenti, mely során a vizsgálati anyag nem egy-egy komponensének koncentrációváltozására irányul, hanem akár több ezer molekula koncentrációjának változását tudja mérhetővé tenni, és ebből olyan információkat szolgáltatni, melyek új irányt adhatnak a növényvédelemnek.
GONDOR ORSOLYA KINGA – JANDA TIBOR – SZALAI GABRIELLA
A munka a GINOP-2.3.-15-2016-00018, és a Prémium_2019-462 sz. projektekhez kapcsolódik.
A cikk a Természet Világa 2020. októberi számában (151. évf. 10. sz.) jelent meg.
