Egyre többet hallunk a baktériumok rezisztenssé válásáról, arról, hogy a jól bevált antibiotikumok hatástalanná válhatnak a jövőben. Ezért van nagy jelentősége az olyan kutatásoknak, amelyek új lehetőségeket, új fegyvereket keresnek a baktériumok elleni harch. Ezek az új lehetőségek pedig gyakran a legváratlanabb helyekről érkeznek. Cikkünkben például egy olyan antimikrobiális hatás nyomába erednek a kutatók, amely a bölcsőszájú halak szájában jelentkezik. Ezek az élőlények a szájukban nevelik utódaikat – és az ikrák védelme úgy tűnik, nem csak fizikai tényezőkkel szemben hatásos, hanem valamilyen, eddig ismeretlen mechanizmus révén a kórokozókkal szemben is működik.
Ötletadó sügérek
Gödöllői tanulmányaim során 2002 körül hallottam először az ikrakeltetőkről, ezekről a mesterséges eszközökről, amelyekkel a halak szaporításában használnak. Már akkor elhatároztam, hogy díszhaltenyészetemben alkalmazni fogom őket. Nyolc évre rá vásároltam meg az első gyári változatot, ezt követően nemsokára már saját tervezésű ikrakeltetőket használva szaporítottam halaimat, elsősorban afrikai sügéreket. Rengeteg ivadékom volt akkoriban, sok szájköltő fajt tenyészettetem. A keltetők lárvanevelésre (az ikrából kikelt szikzacskós ivadék nevelésére) még alkalmasabbnak bizonyultak. Észrevettem, hogy ha az ikrákat a nőstényekkel keltetem, azaz hagyom őket szájban költeni, jobb eredményre számíthatok, így csak a lárvákat vettem el tőlük ezt követően, s őket neveltem az ikrakeltető eszközökben. Voltak a lárvák mellett meg nem termékenyült ikrák, melyek intaktak maradtak a gombaparazitákkal szemben a kelés után 10 napot követően is. Ezt látva jöttem rá, hogy erős antimikrobiális hatás lehet a háttérben, így indult el a kutatás 2012 körül, amelyről végül a Biomedical Journal of Scientific & Technical Research című szakfolyóiratban jelent meg Maász Gábor, Nyitray László és a szerző cikke.
Halbiológosukkal, halgenetikusokkal eredtünk a jelenség nyomába. Egy pilotprojektbe kezdtünk, melynek része volt egy bakteriális, egy tömegspektrometriai (MALDI-TOF) és egy ikrakeltetéses vizsgálat. A bakteriológiai vizsgálatok legfontosabb eredménye az lett, hogy az ikrák felszínén több baktérium található amikor a szülők szájába kerülnek, mint napokkal később, amikor már eltöltöttek egy kis időt a szájüregben. Ez az eredmény antibakteriális hatásra utalt. A tömegspektrometriai vizsgálat igazolta pedig pep-tidek és kisfehérjék jelenlétét a szájüregben.Az ikrakeltetés vizsgálata szintén érdekes eredményekkel zárult. Vizsgáltuk a szájköltés, a keltetés és a gombaölő szer melletti keltetés esetén az ikrák mortalitását, tehát a kelési eredményt. A legmagasabb túlélést a szájban kelt ikráknál kaptuk, csaknem 100 százalékost, az ikrák harmada kelt ki gombaölő szer mellett, és az összes elhalt a keltetőben. Ezen eredmények szintén antimikrobiális hatásra utaltak.
Vírusok ellen is véd?
Akkoriban kezdett elterjedni a Sars-CoV-2 vírus, alakult ki a koronavírus járvány, mely pandémiává vált. Felmerült bennünk, hogy a szájban termelődő peptidek alkalmasak lehetnek a vírusok ellen is. Az irodalomban találtunk forrást hatékony antivirális peptidekről. Kísérletes úton azonban nem tudtunk kimutatni antivirális hatást a halak szájüregéből. Figyelmünk ezért a halak vérében található peptidek felé fordult. Bár tudtuk, hogy lehetnek az állatokban hatékony antivirális peptidek (AVP-k), a kérdés az volt, hogyan találjuk meg ezeket a vérben található „tengernyi” más peptid és fehérje között?
Rájöttünk, hogy leginkább a vírussal tudnánk kiszűrni őket, melyhez kötődniük kell ahhoz, hogy hatékonyak legyenek. Az antivirális peptideknek számos csoportja van, egyesek a vírust úgy gátolják, hogy a termelődését biztosító biokémiai folyamatokat blokkolják sejten belül, mások a vírusfehérjék kötését akadályozzák meg a gazdasejt fehérjéihez, így akadályozva a vírus sejtbe való bejutását. Számunkra az utóbbiak voltak érdekesek.
De milyen módszerrel tudjuk a vérből kiszűrni a vírus segítségével a keresett peptideket? Egy ismert eljárást választottunk, mely egy affinitáskromatográfiás immunológiai módszer, csak mi AVP-kre adaptáltuk. A lényege, hogy a vírust mágneses gyöngyökhöz kötjük a vírusmembrán fehérjék segítségével.
A kísérleti állatok véréből ultracentrifugálással elválasztjuk a megfelelő tömegű frakciót, ami az esetünkben a 30 000 dalton alatti molekulákat jelenti. Ezt a frakciót visszük be a molekulacsapdánkba, azaz affinitáskromatográfiás rendszerünkbe. A kötődni képes molekulák az oszlopban maradnak a vírushoz tapadva, a többi távozik. A minket érdeklő, az oszlopban maradó molekulákat aztán savas glicines oldattal moshatjuk le, így nyerjük ki őket további vizsgálatok céljára.
Peptidek csapdában
Előre tudtuk, hogy a bioaktív molekulák mellett számos más anyag is feltapadhat, így tovább szerettük volna szűkíteni a „találataink” körét. Ezért a vizsgálatokat úgy terveztük, hogy a kísérleti állatokat oltsuk, és előtte, valamint utána is vegyünk vért. Az antigéneket, esetünkben az inaktív vírusokat a vérben molekula-jelzőrendszerek érzékelik, ami a megfelelő antivirális peptidek termelődését elindítja. Ha összehasonlítjuk az oltott és oltatlan állatok véréből a csapdánk által kiszűrt peptideket, akkor láthatjuk, hogy az adott patogén ellen milyen antivirális peptideket kezdtek termelni. Három szűrőt terveztünk tehát, egyrészt méret szerint frakcionálunk, másrészt molekulacsapdát használunk, valamint oltunk.
Mindezen eljárásokon átesett két mintát (oltott, oltatlan) HPLC-MS-el, azaz tömegspektrométerrel kell megvizsgálni, így látjuk az eredményeket, és meghatározható lesz az érdekesnek tűnő peptidek aminosav szekvenciája.
A következő lépés ezeknek a megtalált, vizsgálatra kiválasztott peptideknek a szintetizálása, amely mérettől függően történhet kémiai, vagy biotechnológiai módszerrel, majd elvégezzük rajtuk a vírusneutralizációs tesztet. Utóbbi esetében a vírusra fogékony sejttenyészetre in vitro kell ráoltani a vírust és felvinni a hatóanyagjelölt molekulát. Amennyiben utóbbi blokkolja a vírust a sejtek elpusztításában, alkalmas lehet gyógyszerjelöltként való további vizsgálatokra.
Vakcinaként alkalmazva
Az antimikrobiális peptidek másik alkalmazási lehetősége vakcinákban való felhasználásuk. A vakcinákat az antitestekre optimalizálják, azaz úgy alakítják használatukat, hogy ezekből a szervezet megfelelő mennyiséget termeljen az oltás hatására. Így érik el, hogy az oltás védelmet jelent az oltott szervezet számára. Az AVP-k a szervezet első védelmi vonalát képezik, termelődésük megelőzi az antitestekét. Elsősorban a vírus „felszaporodását” gátolják meg, így szintén alkalmasak lehetnek a betegségek megelőzésére. Ha a vakcinációt úgy alakítanánk, hogy ezen molekulák termelődésére optimalizálnánk azt, szintén kedvező eredményeket kaphatnánk. Kisebb molekulák, azaz megtermelésük nem igényel annyi energiát a szervezet részéről, így a vakcina valószínűleg kevésbé lenne megterhelő a szervezetünk számára. Többször kellene alkalmazni (beadni), mivel gyorsabban megszűnik kedvező hatásuk, de egyszerre kevesebb inaktív vírus bevitele is elegendő lenne. A legmegfelelőbbnek erre a célra az orrspray tűnik, így megvásárlásuk, beadásuk patikában, otthon történhet.
Az AVP-k egy bizonyos koncentráció felett citotoxikusak lehetnek, ennek a kedvezőtlen setjméreg-hatásnak a csökkentése, valamint a vírusfehérjékhez való kémiai kötésük erőssége, s ezzel hatékonyságuknak növelése mesterséges módon befolyásolható. Hogyan lehetne optimalizálni szerkezetüket, mesterséges módon átalakítva azt? Az antivirális peptidek a fehérjékhez az aminosav-oldalláncok közötti másodlagos kötések révén kapcsolódnak. Ha ezeket úgy alakítjuk ki, hogy a peptid-oldalláncok, amennyire lehet, kizárólagosan a velük párban levő fehérje-oldalláncokhoz kapcsolódjanak, kulcs-zár effektust kapunk. Így citotoxikusságuk minimalizálható, azaz a gazdaszervezet fehérjéihez nem, csak a vírus fehérjének a kiválasztott részéhez kapcsolódhatnak.
Az afrikai bölcsőszájú halak csodálatos világa
A bölcsőszájú halak megfigyelésével észlelt érdekes jelenségből tehát több, egymásra épülő elmélet, gondolatmenet következett. A további kutatások, vizsgálatok rengeteg új gyógyszert, új vakcinákat és mesterséges hatóanyagokat eredményezhetnek. Így segíthetnek egyszerű megfigyelések is nagyhatású kutatásokat.
ADORJÁN GÁBOR
IRODALOM
[1] Gwyer Findlay E, Currie SM, Davidson DJ (2013) Cationic host defence peptides: potential as antiviral therapeutics. Bio Drugs 27(5): 479-493.
[2] Mahendran ASK, Lim YS, Fang CM, Loh HS, Le CF (2020) The Potential of Antiviral Peptides as COVID-19 Therapeutics. Front Pharmacol 11: 575444.
[3] Hu H, Guo N, Chen S, Guo X, Liu X, et al. (2019) Antiviral activity of Piscidin 1 against pseudorabies virus both in vitro and in vivo. Virology Journal 16: 95.
[4] Shahin Ramazi, Neda Mohammadi, Abdollah Allahverdi, Elham Khalili, Parviz Abdolmaleki (2022) A review on antimicrobial peptides databases and the computational tools. Database 2022(2022): baac 011.
[5] Li P, Guo R, Liu Y, Zhang Y, Hu J, et al. (2021) The Rhinolophus affinis bat ACE2 and multiple animal orthologs are functional receptors for bat coronavirus RaTG13 and SARS-CoV-2. Sci Bull (Beijing) 66(12): 1215-1227.
[6] Wang G (2014) Human antimicrobial peptides and proteins. Pharmaceuticals (Basel) 7(5): 545-594.
[7] Broadfoot M (2022) Nose spray vaccines could Quash COVID virus variants. Scientific American.
[8] Lan J, Ge J, Yu J, Sisi Shan, Huan Zhou, et al. (2020) Structure of the SARS-CoV-2 spike receptor-binding domain bound to the ACE2 receptor. Nature 581: 215-220.
[9] Barh D, Tiwari S, Silva Andrade B, Giovanetti M, Kumavath R, et al. (2020) Potential Chimeric Peptides to Block the SARS-CoV-2 Spike RBD. Preprints 2020040347.
[10] Gábor Adorján, Gábor Maász and László Nyitray. Using the Power of Nature Against Pathogens Searching for Antiviral Peptides Effective Against SARS-CoV-2 (In Fish, Bats, and Humans). Biomed J Sci & Tech Res 50(4)- 2023. BJSTR. MS.ID.007981.
