A kombinatorikus kémia
A kombinatorikus kémia az új évszázad
szintetikus kémiája. E futurisztikus kijelentés volt
a címe annak a tudományos szimpóziumnak, amelyet az
amerikai Tucsonban rendeztek a közelmúltban. Vajon mi az a
kombinatorikus kémia, amit ilyen kivételes jelzõvel
illetnek? Ez a kérdés annál is inkább választ
igényel, mivel e tudományág egyik fõ szülõhelye
Magyarország.
A kombinatorikus kémia gyökerei Magyarországon
A tudomány és a technika fejlõdésében nagy szerepet játszik az új anyagok és új vegyületek elõállítása. Az új szerkezeti anyagok, új félvezetõk, új szupravezetõk, hatásosabb fénykibocsátó anyagok megjelenése mind-mind új alkalmazásokat, esetenként új iparágak születését teszi lehetõvé. Az egészségügy fejlõdése jelentõs mértékben az új és hatásosabb gyógyszerek megjelenésétõl függ, ami rendszerint szintén új szerves vegyületek egész sorának elõállítását igényli. A tapasztalatok szerint egy új gyógyszer kifejlesztéséhez átlagosan mintegy tízezer új vegyületet kell elõállítani és megvizsgálni. Ezeket a vegyületeket a nyolcvanas évekig igen fáradságos és költséges munkával egyenként állították elõ és egyenként végezték el a hatásvizsgálatokat is. Ugyanakkor az iparban a nagy sorozatú mûszaki termékek elõállításánál már régóta alkalmazták a futószalagot és újabban az automatizálást, ami a termelékenység ugrásszerû növekedésével és a költségek nagymértékû csökkenésével járt. Manapság tízezer autó elõállítására már sehol sem alkalmaznának kisipari, manufakturális módszereket. Az a tízezer vegyület, aminek elõállítását egy-egy új gyógyszer kifejlesztése rendszerint megkövetel, már olyan mennyiség, amely ipari szervezési módszerek bevezetését igényelné. Erre azonban a nyolcvanas évek elõtt senki sem gondolt. Ezt a helyzetet változtatta meg alapvetõen a kombinatorikus kémia, ami a gyógyszeriparban nyert elõször alkalmazást, és a gyógyszeripari kutatásban a mérvadó vélemények szerint forradalmi átalakulást idézett elõ.
Az új tudományágat megalapozó kutatók, köztük e sorok írója, nem a futószalagok analógiájára alkották meg az új módszereket. Ezt legjobban az bizonyítja, hogy futószalagszerû vegyület-elõállítás még ma sem létezik. A kutatók más-más elgondolásokból kiindulva jutottak el a kombinatorikus módszerekig. Ennek a cikknek a témáját – a kombinatorikus kémia lényegének felvillantásán túl – annak bemutatása képezi, hogy az Eötvös Loránd Tudományegyetemen mûködõ kutatócsoportunkban milyen meggondolások révén jutottunk el a kombinatorikus kémiához.
Az elõzmények 1964–65-re nyúlnak vissza, amikor egyéves kanadai tanulmányúton vettem részt az Albertai Egyetem biokémiai tanszékén. Ekkor a kutatócsoport többi tagjával együtt sikerült meghatároznunk egy 245 aminosavból álló fehérje, a kimotripszinogén-B aminosavsorrendjét. A fehérjék 20-féle aminosav láncszerû összekapcsolódásával jönnek létre. Ezeket az aminosavakat az ábécé következõ betûivel jelölik: A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W és Y. Az egyes fehérjék abban különböznek egymástól, hogy molekuláikban az egyes aminosavak hányszorosan vannak képviselve és mi azok sorrendje a láncban. Miután visszatértem Budapestre, kíváncsi lettem arra, hogy vajon hány eltérõ aminosavsorrend közül választottuk ki kísérleteink eredményeként a helyes sorrendet, azaz, a 245-ös tagszámú fehérjék között hány eltérõ aminosavsorrend létezhet. Ezt egy egyszerû képlet alkalmazásával ki lehetett számítani (20245). Az eredményt közelítõleg egy olyan szám fejezi ki, amelyben 6 után 318 nulla következik. Ahhoz, hogy meg tudjam becsülni, hogy ez mekkora szám, valamihez hasonlítani kellett. Minthogy kétségtelenül csillagászati számnak tûnt, kézenfekvõ volt a világegyetem adataihoz hasonlítani. Tételezzük fel, hogy valami csoda folytán bármely anyagot 245-ös tagszámú fehérjékké tudnánk átalakítani, és mindezt úgy végeznénk, hogy mindegyik fehérjébõl csupán egyetlen molekula készüljön. Kiderülne, hogy a belátható világegyetem teljes anyagát felhasználva is, a minden lehetséges fehérjemolekulát tartalmazó vegyülettárnak csupán csak egy parányi töredékét kaphatnánk meg. Ezt könnyen beláthatjuk, ha figyelembe vesszük azt a becslést, amely a belátható világegyetem óriási anyagmennyiségét felépítõ (az atomoknál is kisebb) elemi részek számára vonatkozik. Ez egy olyan szám, amelyben 1 után „csak” 88 nulla van, szemben a molekulák sokféleségét kifejezõ szám 318 nullájával. A molekuláknak ez a szinte minden képzeletet felülmúló lehetséges szerkezeti változatossága akkoriban megrázó élmény volt számomra.
Az elkövetkezõ években megfeledkeztem errõl az élményrõl, de késõbb, 1980 táján, amikor peptidek elõállításával foglalkoztunk, ismét eszembe jutott. A peptidek a fehérjékhez hasonlóan aminosavakból épülnek fel, de lánchosszúságuk sokkal rövidebb a fehérjékénél. Attól függõen, hogy felépítésükben hány aminosav vesz részt, beszélünk dipeptidekrõl (2 aminosav), tripeptidekrõl (3 aminosav), tetrapeptidekrõl (4 aminosav) vagy pentapeptidekrõl (5 aminosav) és így tovább. Így például APTKL vagy PATKL egyaránt pentapeptid. Különbség köztük csupán az elsõ és a második aminosav sorrendjében van. A peptidek lehetséges száma, ugyanúgy mint a fehérjéké, pontosan kiszámítható. Így például a lehetséges dipeptidek száma 400, a tripeptideké 8000, a tetrapeptideké 160 000, a pentapeptideké 5 200 000. Ahogy nõ az aminosavszám a peptidekben, úgy hússzorozódik a lehetséges számuk. A peptidek között szép számmal vannak biológiailag hatásos molekulák. Ahhoz, hogy ezeket megtaláljuk, a peptideket elõbb elõ kell állítani, majd biológiai hatásukat megvizsgálni. Csábítónak tûnt volna elõállítani például az összes tetrapeptidet vagy pentapeptidet. Errõl azonban abban az idõben még csak álmodni sem lehetett. A peptideket egyenként állítottuk elõ. A leghatékonyabb eljárás abban az idõben az amerikai Merrifield professzor 1963-ból származó szilárdfázisú módszere volt, amelynek kidolgozásáért 1984-ben Nobel-díjban részesült (Merrifield, 1963). Ennek leegyszerûsítve az a lényege, hogy az elsõ aminosavat hozzákapcsoljuk egy finomszemcsés szilárd hordozóhoz. Ezután újabb aminosavat kapcsolunk az elõzõhöz és ezáltal egy dipeptid képzõdik a hordozón.
Az aminosavak egyenkénti kapcsolását addig folytathatjuk, amíg elérjük a kívánt lánchosszt. Ezután a kész peptidet lehasítjuk a hordozóról.
A szilárdfázisú módszer nagy elõnye, hogy kapcsolásakor az aminosavakat és egyéb reagenseket nagy feleslegben lehet alkalmazni – és ezáltal teljesebb átalakulást lehet elérni – mert ezeket a reakció végén egyszerû szûréssel el lehet távolítani. A lehasított peptid oldatát szintén szûréssel lehet megkapni, amelybõl a peptid fárasztó tisztítási lépések mellõzésével viszonylag tisztán különíthetõ el.
A szilárdfázisú módszerrel naponta egy-egy
kapcsolási lépést lehetett elvégezni, tehát
például egy tetrapeptid elõállítására
mintegy négy napot kellett áldozni. Ilyen tempó mellett
a 160 ezer tetrapeptid elõállítását
körülbelül az idõszámításunk
kezdetén kellett volna elkezdeni, hogy napjainkra a teljes peptidtár
elkészülhessen. A teljes pentapeptidtár elkészítése
pedig ennél is hússzor több idõt vett volna igénybe.
Sokat gondolkoztam a megoldás lehetõségein, és
legelõször az kínálkozott, hogy az egyes kapcsolási
lépéseknél egyetlen aminosav helyett az összes
aminosav keverékét alkalmazzuk. Ilyenkor elvileg várni
lehetne az összes lehetséges peptid keletkezését
keverék formájában. E megoldást mégis
elvetettem. Ennek az az oka, hogy az egyes aminosavak eltérõ
reakciókészsége miatt a peptidek nagyon eltérõ
mennyiségben keletkeznének, ez pedig nagy nehézségeket
okozna a biológiailag hatásos peptidek azonosításában.
Majdnem két évtizeddel ezelõtt, 1982 tavaszán,
egy Békés megyei faluban, Kunágotán töltöttem
a hétvégét és nem is gondoltam a peptidszintézisre.
Az egyik reggelen mégis arra ébredtem, hogy megvan a tökéletes
megoldás. Az alább ismertetendõ un. „megosztásos
keveréses” eljárás annyira egyszerû, hogy amint
azt azóta sokan mondták már nekem, akárki másnak
is eszébe juthatott volna.
A megosztásos-keveréses eljárás
Az új eljárás a szilárdfázisú szintézismódszeren alapul, úgy, hogy annak kapcsolási lépéseit három egyszerû mûvelettel helyettesítjük.
– A szilárd hordozót annyi egyenlõ adagra osztjuk, ahány aminosavból akarjuk felépíteni a peptidtárat. Teljes peptidtár esetén 20 adagra osztunk.
– Mindegyik adaghoz más-más aminosavat kapcsolunk.
– Kapcsolás után az adagokat egyesítjük és alaposan összekeverjük.
Ezután addig ismételjük a fenti mûveleteket, míg a peptidek elérik a kívánt hosszúságot, majd a keletkezett peptideket lehasítjuk a hordozóról. A szintézis folyamatábráját egy egyszerû esetre vonatkozóan az 1. ábra szemlélteti. Dipeptidek két lépésben történõ szintézisérõl van szó, amikor is mindkét lépésben ugyanazt a három aminosavat (E, G, K) használjuk a kapcsolásokban. A szilárd hordozót a köröcskék szimbolizálják. A hordozó szétosztását a szétágazó nyilak, a kapcsolásokat a lefelé mutató párhuzamos nyilak, a minták egyesítését és keverését pedig az összetartó nyilak jelzik. Az ábra azt is mutatja, hogy a folyamat során keletkezõ 9 dipeptid mindazon aminosavsorrendeket tartalmazza, amelyek a három kiindulási aminosavból levezethetõk. A folyamatnak ez a jellegzetessége, hogy végrehajtása során minden lehetséges szerkezeti kombináció keletkezik, akkor is érvényesül, ha akárhány kiindulási aminosavat használunk, akárhány kapcsolási lépésben és kiindulási anyagokként aminosavak helyett bármilyen más szerves vegyületeket is használhatunk. Ez tehát egy valóságos kombinatorikus eljárás, amelynek egyszerû végrehajtása minden egyéb trükk nélkül biztosítja minden lehetséges szerkezeti variáns képzõdését. A kombinatorikus kémia innen nyerte elnevezését.
1. ábra. A megosztásos-keveréses szintézis folyamatábrája
Annak, hogy a szintézis során a hordozót egyenlõ adagokra osztjuk és az adagokat aminosav-keverék helyett egyetlen aminosavval kapcsoljuk, fontos következményei vannak. Az egyenlõ adagokra történõ osztás biztosítja azt, hogy a vegyülettár komponensei egyenlõ moláris mennyiségben képzõdjenek. Az egyetlen aminosavval történõ reakció pedig kiküszöböli azokat a hibákat, amelyek az aminosavak eltérõ reakciókészségébõl erednének. Az egyetlen aminosavval történõ kapcsolás során az aminosavak nem versenyeznek egymással. A kérdéses aminosavat nagy feleslegben is lehet alkalmazni, sõt a kapcsolást akárhányszor meg lehet ismételni, mindaddig, amíg a kapcsolási átalakulás teljesen lejátszódik. Ilyenkor a keletkezõ vegyületek mólarányára az van elsõsorban befolyással, hogy a hordozóadagok mennyire egyenlõek. Van azonban egy másik, nem kevésbé fontos következmény is. Mivel a kapcsolás mindig csak egyetlen aminosavval történik, nincs lehetõség arra, hogy a hordozóanyag egyes szemcséin egynél több anyag keletkezzék. Az, hogy egy tetszõlegesen kiválasztott szemcsén mely vegyület – azaz például milyen aminosav-sorrendû peptid – képzõdik, az attól függ, hogy az egyes reakciólépéseket megelõzõ porciózások során a kérdéses szemcse véletlenszerûen mely adagokba került és ezeket az adagokat mely aminosavakkal reagáltattuk. A megosztásos-keveréses eljárásnak ez a jellegzetessége végeredményben azt jelenti, hogy az elõállított vegyülettár komponensei a hordozóról történõ lehasítás elõtt nem keverékként, hanem egyedi vegyületekként vannak jelen. Tényleges keverék csak a hordozóról történõ lehasítás során keletkezik. Megjegyzendõ azonban az is, hogy mivel a szemcsék ránézésre egyformák, nem tudjuk megmondani, hogy melyik szemcsén melyik vegyület van. A vegyület azonosítását külön kísérlettel kell megállapítani. Ennek ellenére az egy szemcse – egy vegyület sajátságnak messzemenõ elõnyei vannak, amelyek a hatásos vegyület kiválasztásának megkönnyítésében nyilvánulnak meg.
A már említett elõnyök mellett a megosztásos-keveréses eljárásnak van olyan rendkívüli tulajdonsága is, amelyet talán elsõként kellett volna említeni. Ez pedig a rendkívüli hatékonyság. Ezt a tulajdonságot talán jól jellemzi a következõ összehasonlítás. Abban az idõben, amikor a módszer elve született, az ismert szerves vegyületek száma, tehát azon vegyületek száma, amelyeket a szerves kémia egész korábbi története során elõállítottak, mintegy 10 millió volt. Az új módszerünkkel pedig ennél több vegyületet (mintegy 64 millió peptidet) lehetett egyetlen hét alatt elõállítani. Vajon mire vezethetõ vissza ez a soha nem is álmodott hatékonyság? Ha rápillantunk a folyamatábrára, azt látjuk, hogy az elsõ kapcsolási lépés során három új anyag keletkezik. Ezek a hordozóhoz kapcsolt aminosavak.
E-o, G-o és K-o
Az összekeverés és a porciózás után mindhárom adagban megjelenik mindhárom anyag. Ennek az a következménye, hogy a második kapcsolási lépésben mindegyik adagban 3 új anyag keletkezik (három hordozóhoz kötött dipeptid) annak ellenére, hogy mindegyik adagon csak egy kapcsolást hajtunk végre. A három adagban összesen 9 dipeptid képzõdik. Ha a megosztást és a három aminosavval való kapcsolást még egyszer megismételnénk, 27 tripeptidhez jutnánk. A szintézis során befektetett munka mennyiségét legjobban a végrehajtott egyedi kapcsolások számával fejezhetjük ki. Ezt úgy kaphatjuk meg, ha a feltételezett három kapcsolási lépés során elvégzett kapcsolások számát összeadjuk:
3 + 3 + 3 = 9.
A keletkezett vegyületek számát viszont úgy számíthatjuk ki, ha az egyes lépések során elvégzett kapcsolások számát összeszorozzuk:
3 x 3 x 3 = 27.
Más szóval, amíg a megosztásos-keveréses szintézis során a befektetendõ munka csupán lineárisan növekszik, addig a képzõdõ vegyületek száma exponenciálisan nõ a kapcsolási lépések számával. Ez a kivételesen nagy hatékonyság magyarázata. A hatékonyságot egy gyakorlati példával is célszerû illusztrálni. Az egyszerûség kedvéért maradjunk ismét a peptideknél. Ha minden kapcsolási lépésben 20 aminosavval dolgoznánk, és ezt a 20-20 kapcsolást mindennap elvégeznénk (ami egyébként nem különösebben megerõltetõ, ha 20 reakcióedényben minden mûveletet párhuzamosan végzünk), az eltelt napok számától függõen a következõ számú peptidet állíthatnánk elõ: 2 nap: 400 dipeptid, 3 nap: 8000 tripeptid, 4 nap: 160 000 tetrapeptid, 5 nap: 3 200 000 pentapeptid, 6 nap: 64 000 000 hexapeptid és 7 nap: 1 280 000 000 heptapeptid. A sort lehetne folytatni, de a szintézis során megmozgatandó anyagmennyiségek és oldószertérfogatok már meghaladnák a szokásos laboratóriumi léptéket. Ez azt jelenti, hogy az elõállítandó új vegyületek számát már nem a rendelkezésre álló munkaidõ, hanem a szükséges anyagmennyiségek korlátozzák. Hogy egy végtelenül szélsõséges példát is említsünk, és egyben visszautaljunk a cikk elején említett 245-ös tagszámú fehérjékhez, egy vegyész minden további nélkül feláldozhatna életébõl 245 napot arra, hogy egy ilyen fehérjetárat elõállítson, sajnos azonban a világegyetem anyaga, beleértve õt magát is, sokkal elõbb elfogyna, mintsem a tár elkészülne.
A megosztásos-keveréses szintézis gyakorlatba ültetéséhez szükséges kísérletek túlnyomó részét munkatársam, dr. Sebestyén Ferenc docens és etiópiai doktorandusza Mamo Asgedom végezte el. Az analízisek elvégzésében közremûködött még dr. Dibó Gábor docens, a kézi szintetizátor megszerkesztésében pedig kanadai kollégánk, dr.Jozsef Durgo is. Ezt a szintézisek során használt egyszerû, kézi mûködtetésû készüléket a 2. ábra mutatja. Fõ darabja egy rázógépre helyezett vízszintes, furatokkal ellátott evakuálható alumíniumcsõ, amelyhez tömítés közbeiktatásával csatlakoztathatók a függõleges állású reakcióedények, amelyek tulajdonképpen aljukon zsugorított üvegszûrõvel és csappal ellátott üvegcsövecskék.
2. A megosztásos-keveréses eljárás kézi mûködtetésû szintetizátora
A kapcsolások végrehajtása céljából
a hordozó gyantát, az oldószert, az aminosavak megfelelõ
származékait és a reagenseket a zárt csapállás
mellett a csövecskékbe vittük, a csöveket bedugaszoltuk,
majd az alumíniumcsövet vízszintes tengely körül
mintegy 50o-kal elfordítottuk (2. ábra) és
rázattuk mindaddig, míg a kapcsolási reakció
a ferde állású csövecskékben lejátszódott.
Ezután a csövecskéket függõlegesre állítottuk,
eltávolítottuk a dugót, kinyitottuk a csapot és
a reagensek feleslegét tartalmazó oldatot szívatással
eltávolítottuk, majd a gyantát többször
mostuk. Ezután a csövecskében maradó gyantaadagokat
egy erre a célra szolgáló edényben egyesítettük,
nitrogén átbuborékoltatásával alaposan
összekevertük, majd ezután a zagyot pipettával
szétmértük a reakcióedényekbe, majd kezdõdhetett
az újabb kapcsolási lépés. A megosztásos-keveréses
módszert 1988-ban két tudományos kongresszuson (Furka
és m.-társai 1988) majd 1991-ben egy amerikai folyóiratban
publikáltuk (Furka és m.-társai 1991). Bár
ezzel a házi készítésû készülékkel
is kényelmesen elvégezhetõ volt a fentebb már
említett napi 20 párhuzamos kapcsolás, az amerikai
Advanced ChemTech cég automata készüléket is
forgalomba hozott. Ez az ACT 357 jelû készülék
minden, a szintézis során elõforduló mûveletet
automatikusan végez el a hozzá kapcsolt számítógép
vezérletével.
Tû a szénakazalban
A kombinatorikus kémia születésének legkorábbi idõszakában is felvetõdött már az a kérdés, hogy vajon mit lehet egy sokkomponensû keverékkel kezdeni és meg lehet-e valaha is állapítani, hogy egy ilyen bonyolult keverék mely alkotórésze hordoz egy számunkra elõnyös biológiai hatást. Mintha csak egy tût keresnénk a szénakazalban!
A problémára többféle megoldás született. E helyen a legkorábbi változat elvét ismertetjük, amelyet már az ötlet születése idején, 1982-ben megfogalmaztunk. (Ez is megtalálható abban a legkorábbi hiteles dokumentumban, amelyben a kombinatorikus kémia alapelvei vannak kifejtve. A dokumentum az eredeti magyar nyelvû változatban és angol fordításban is olvasható az interneten, címe: https://szerves.chem.elte.hu/Furka. Késõbb mások is publikálták ennek elvét és gyakorlati megvalósítását (Geysen és mtársai 1986, Houghten és m.-társai 1991)).
Manapság el lehet tûnõdni azon, hogy a kombinatorikus elveket már a kombinatorikus kémia születése elõtt is alkalmazták, méghozzá a kémiától meglehetõsen távol álló területen, a bûnüldözésben. Az a folyamat, amikor egy szemtanú a rendõrségen készült mozaikkép alapján azonosítja a bûnelkövetõ arcvonásait, lényegét tekintve azonos a kombinatorikus kémiában alkalmazott iterációs eljárással. Ennek az a lényege, hogy az arckép részekre van osztva (fejtetõre, homlokra, szemekre, orra, szájra, állra), amelyek mindegyikébõl sokféle változatot elõre elkészítettek. Ezekbõl az arcrészletekbõl gyakorlatilag minden elképzelhetõ arc összekombinálható. Az összes arckombináció, azaz egy teljes arctár módjára létrehozható vegyülettár is: például peptidtár. Így a bioaktív peptid azonosításának elve nagyon hasonlatos az arcazonosítás folyamatához. Tegyük fel, hogy a szemtanú szerint a gyanúsított kopasz. Ezáltal az arctár összes nem kopasz arcát el lehet vetni és teljes joggal feltételezhetjük, hogy a gyanúsított arca fellelhetõ az arctár kopasz fejû képviselõi között. Most már a kopasz fejhez próbálunk homlokokat illeszteni. Ha a szemtanú megállapítja, hogy alacsony, erõsen ráncos homlok illik oda, a nem kopasz fejûek mellett nyugodtan kizárhatjuk a gyanúsítottak közül a nem alacsony és nem ráncos homlokúakat is. Innen úgy megyünk tovább, hogy a kopasz fejhez és a megfelelõ homlokhoz keresünk megfelelõ szempárt, majd orrot, szájat és állat. Ha mindent kiválasztottunk, elõáll a gyanúsított arcmása, amit a szemtanú felismer.
3. ábra. A bioaktív peptid aminosavsorrendjének meghatározása iterációs eljárással
Az iterációs eljárás során hasonló módon, lépésenként azonosítjuk a bioaktív peptid egyes kapcsolási pozícióit elfoglaló aminosavakat. Ezt egy olyan egyszerû tripeptidtárral mutatjuk be a 3. ábrán, amelynek szintézisekor mindhárom kapcsolási helyen ugyanazt a három, fehér, szürke és fekete köröcskével jelölt aminosavat használjuk fel, továbbá úgy járunk el, hogy a kapcsolások után – még az összekeverés elõtt – mindegyik adagból kiveszünk és félreteszünk egy-egy kis mintát késõbbi felhasználás céljából. Legelõször a bioaktív peptid 3. kapcsolási helyét elfoglaló aminosavat határozzuk meg azáltal, hogy az utolsó (3-as számú) kapcsolási lépés során kivett három mintát vetjük alá hatásvizsgálatnak. Tételezzük fel, hogy a + jelû, harmadik (jobb oldali) minta mutatja a hatást. Ez azt jelenti, hogy a bioaktív peptid ebben a mintában van jelen. A három mintát alkotó peptidek csak abban térnek el egymástól, hogy a harmadik kapcsolási pozíciót a „fehér”, a „szürke”, vagy a „fekete” aminosav foglalja el. Mivel a hatást mutató (+) mintában minden peptid 3. (bal oldali legszélsõ) kapcsolási pozícióját a szürke aminosav foglalja el, kézenfekvõ elfogadni, hogy a hatást mutató peptid harmadik pozícióját is a szürke aminosav foglalja el. A bioaktív peptid másik két aminosava még bizonytalan, ezért azokat kérdõjelekkel jeleztük. Ezután a 2. kapcsolási pozíciót elfoglaló aminosavat határozzuk meg. Elõvesszük a második kapcsolási lépés után kivett három mintát és a mintákat alkotó dipeptidekhez hozzákapcsoljuk a szürke aminosavat (hasonlóan ahhoz, hogy például mindegyik archoz kopasz fejet illesztünk), hiszen már megállapítottuk, hogy a bioaktív peptidben az áll az utolsó kapcsolási helyen. Így három olyan keverékhez jutunk amelyeket alkotó peptidtár komponensei csak abban különböznek egymástól, hogy a fehér, a fekete, vagy a szürke aminosav foglalja el a második (középsõ) kapcsolási helyet.
A három mintát ismét hatásvizsgálatnak vetjük alá. Tegyük fel, hogy a + jellel megjelölt középsõ minta mutatja a hatást. Ebben a mintában minden peptid 2. (középsõ) kapcsolási pozícióját fekete aminosav foglalja el. Mivel ezek között van a bioaktív peptid is, következésképpen ennek a második (középsõ) aminosava is fekete. Nyugodtan leírhatjuk a szürke után a fekete köröcskét, és már csak a jobboldali aminosav helyére kerül kérdõjel. Utoljára azt az aminosavat határozzuk meg, amely közvetlenül a hordozóhoz volt kapcsolva, azaz az 1. kapcsolási pozíciót elfoglaló aminosavat. Elõvesszük az elsõ kapcsolási lépés után félretett három mintát, és mindegyikhez elõbb fekete, majd szürke aminosavat kapcsolunk. A kapcsolás után mindhárom mintát egy-egy tripeptid alkotja. Ezek második és harmadik aminosava azonos (hisz ezeket mi kapcsoltuk hozzájuk), különbség csak az 1. kapcsolási pozíciót elfoglaló aminosavakban van. Ismét tételezzük fel, hogy a hatást a + jellel megjelölt minta mutatja. Az abban levõ peptid tehát a bioaktív peptid, és annak elsõ kapcsolási helyét a fehér aminosav foglalja el. A bioaktív aminosavsorrend tehát balról jobbra: szürke-fekete-fehér.
Az elmúlt években a megosztásos-keveréses
szintézisnek többféle változatát is kidolgozták.
Többféle stratégiát vezettek be arra vonatkozóan
is, hogy a megosztásos-keveréses szintézissel készült
vegyülettárakban hogyan lehet azonosítani a bioaktív
vegyületet, vagy más szempontból fontos vegyülettár-komponenseket,
például a katalitikus hatással rendelkezõ szerves
vegyületeket. Ugyancsak léteznek olyan kombinatorikus szintézismódszerek
is, amelyek alapelve eltér a megosztásos-keveréses
szintézis alapelvétõl.
A párhuzamos szintézis
A kombinatorikus kémiának van egy olyan ága is, amely nem a szó szerint vett – és fentebb bemutatott – kombinatorikus szintéziseken alapul, hanem több hagyományos kémiai szintézis párhuzamos elvégzésén. Ezek révén ugyan gyorsabban készülhetnek új vegyületek, mint a korábban szokásos egyenkénti szintézissel, de hatékonyságuk meg sem közelíti a valódi kombinatorikus szintézisekét.
4. ábra. A Geysen-féle multipin készülék
A párhuzamos szintézis elvét elõször Geysen és munkatársai alkalmazták (Geysen és m.-társai 1984) peptidek szintézisére Ausztráliában. Készülékük vázlata a 4. ábrán látható. Ennek egyik részét egy mûanyag lap alkotja, amelybe lyukacskákat fúrtak (4. c felülnézet, 4. b oldalnézet). A lyukacskák alkotják a reakcióedényeket. Ezekbe helyezték el a különbözõ aminosav-származékok oldatát és a kapcsoló reagenseket. Van egy másik lap is, a fedél (4. a), amelybe merõlegesen gyufaszálszerû (eredeti fogalmazás szerint gombostûszerû) elemek vannak illesztve. A szálacskák végén bevonat van (az ábrán fekete színû), amely azt a szerepet tölti be, mint egy szilárd hordozó. A fedél ráhelyezésekor a szálacskák belenyúlnak a reakcióedényekbe, és rajtuk végbemegy a kapcsolási reakció. A kapcsolási reakciók végén az oldatokat kiöntik és a szálacskákat bemártással többször kimossák. Attól függõen, hogy az egyes kapcsolási lépésekben az egyes reakcióedényekbe mely aminosav-származékot tették, a szálacskák végén más-más peptid képzõdik. A szintézis végén a képzõdött peptideket vagy más természetû vegyületeket lehasíthatják a szálacskákról, de úgy is végezhetõk hatásvizsgálatok (ún. kötõdési kísérletek), ha a képzõdött vegyületeket a szálacskákon hagyják.
A párhuzamos szintézis automatizált változatait is kidolgozták. Erre a célra olyan készüléket használnak (ACT 384 HTS), amely számítógép vezérletével egyetlen menetben 384 vegyület automatikus szintézisét végzi el.
A készülékben négy, egyenként 96 reakcióedényt tartalmazó teflontömb van. Ezek rázhatók, hûthetõk és fûthetõk. A reakcióedények a teflontömbökbe vannak fúrva, és aljukon szûrõ található. A finomszemcsés hordozót belemérik a reakcióedényekbe, majd a kiindulási vegyületek és reagensek oldatát, valamint az oldószereket és a mosófolyadékokat a számítógépes program szerint két karra szerelt pipetta hordja szét. Ugyancsak beprogramozható a rázás idõtartama, valamint szükség szerint a fûtés és a hûtés hõfoka és idõtartama. A reakcióedényenként elõállított anyag mennyisége mintegy 10–50 milligramm.
A párhuzamos szintézisnek még az automatizált változata is nagyon lassú és költséges a valódi kombinatorikus szintézisek teljesítményéhez viszonyítva. Mégis sok helyen elõszeretettel alkalmazzák. Ennek két oka van. Az egyik az, hogy a programkészítés során elõre meg lehet határozni, hogy az egyes reakcióedényekben mely vegyületek keletkezzenek, tehát az elõállított anyagokról pontosan tudni lehet, hogy melyik micsoda. Nincs szükség külön eljárásra ennek megállapításához. A másik ok az elõállított anyagok mennyiségével kapcsolatos. Amíg a megosztásos-keveréses szintézis során egy-egy szemcsén csupán egy-két kísérletre elegendõ anyagmennyiség keletkezik, a párhuzamos reakciókban elõállított 10-50 milligramm anyag számos kísérletre és ismétlésre elegendõ, sõt még tárolásra is jut belõle. Megjegyzendõ azonban, hogy a megosztásos-keveréses eljárásnak kidolgozták már azokat a változatait is, amelyek a párhuzamos szintézisnek mind a két fentebb említett elõnyével rendelkeznek, amellett pedig megõrzik az eredeti eljárás nagy termelékenységét is. A legújabb (jelenleg éppen publikálás alatt álló) ilyen eljárást e cikk írója és amerikai munkatársai dolgozták ki.
A megosztásos-keveréses eljárás közzététele után nyilvánvalóvá vált, hogy olyan technika került a vegyészek kezébe, amely szinte korlátlan számú új vegyület szintézisét teszi lehetõvé. Ennek óriási hatása volt. Sok-sok új, elsõsorban gyógyszerkutató vállalatot alapítottak ennek a technikának a hasznosítására, az óriáscégek sokmillió dolláros befektetésekkel pedig rendre kombinatorikus részlegeket hoztak létre. Különösen az Egyesült Államokban volt igen nagy a cégalapítási kedv. Mára már a régebben alapított kis cégek egy részét az óriáscégek felvásárolták és helyüket újabban alapítottak foglalták el. Nagy öröm, hogy Magyarországon is mûködik egy igen sikeres kombinatorikus cég, a ComGenex (alapítója dr. Darvas Ferenc), és gyógyszergyárainkban is alakultak kombinatorikus kémiai csoportok. Azt azonban csak sajnálni lehet, hogy ezek a csoportok nem az egész világot megelõzve jöttek létre.
A kombinatorikus kémia ma már elismert önálló tudományággá vált. Az Egyesült Államokban a stratégiailag fontos tudományágak közé sorolják. Számos kombinatorikus tárgyú folyóirat jelenik meg és a publikált könyvek száma is igen számottevõ. Az évenkénti szimpóziumok számát alig lehet már számon tartani. Tavaly, a Kombinatorikus Tudományok Európai Társasága is megalakult és ehhez csatlakozott a Magyar Kémikusok Egyesületének kombinatorikus kémiai munkabizottsága is. Az európai szervezet elsõ kombinatorikus szimpóziumát 2001 júliusában rendezik Budapesten.
Az elmondottak ellenére a kutatók többsége úgy gondolja, hogy a kombinatorikus kémia fejlõdésének csak a legelején tart, igazi fejlõdése csak most következik. Több kutató osztja azt a megállapítást, hogy a kombinatorikus kémia eddigi legfõbb eredménye – túl az igen jelentõs gyakorlati eredményeken – az a változás, amelyet a kutatók gondolkodásmódjában idézett elõ. Ezt a véleményt látszik alátámasztani az, hogy ez a gondolkodásmód lassan kezd átszivárogni más tudományágakba is, köztük például az anyagtudományokba és a biológiába.
Irodalom
Merrifield, R. B. J. J. Am. Chem. Soc. 85, 2149 (1963).
Furka, Á.; Sebestyén, F.; Asgedom, M.; Dibó, G.
In Highlights of Modern Biochemistry, Proceedings of the 14th International
Congress of Biochemistry, VSP. Utrecht, The Netherland, 1988; Vol. 5, p.
47.
Furka, Á.; Sebestyén, F.; Asgedom, M.; Dibó, G.
Proceedings of 10th International Symposium of Medicinal Chemistry, Budapest,
Hungary, 1988; p. 288, (1988)
Furka, Á.; Sebestyén, F.; Asgedom, M.; Dibó, G.
Int. J. Peptide Protein Res. 37, 487, (1991).
H. M. Geysen, R. H. Meloen, S. J. Barteling, Proc. Natl. Acad. Sci.
USA 81, 3998 (1984).
H. M. Geysen, S. J. Rodda, T. J. Mason, Mol. Immunol. 23, 709
(1986).
R. A. Houghten, C. Pinilla, S. E. Blondelle, J. R. . Appel, C. T. Dooley,
J. H. Cuervo, Nature 354, 84 (1991).