BIOTECHNOLÓGIA

Ez év márciusában kelt szárnyra a hír: megszületett Dolly, az elsô klónozott élôlény, amely kifejlett állat egyetlen testi sejtjébôl származik. Írásomban arra vállalkoztam, hogy bemutassam azt a folyamatot, ami Dolly születéséhez vezetett, összefogIaljam azokat a kísérleteket, amelyeket az elmúlt néhány évtizedben a kIónozás területén folytattak és megismertessem az olvasóval ezen eredmények tudományos jelentôségét. Nem titkolt szándékom továbbá, hogy cikkemmel eloszlassam azokat a félelmeket és tévhiteket, amelyek a hír hallatán felvetôdnek. Mielôtt azonban belevágnék a részletekbe, röviden és tömören bemutatom azokat a fôbb lépéseket, amelyek lehetôvé tették Dolly megszületését.

A tudósok elôször felnôtt nôstény birka emlôszövetének sejtjeibôl sejttenyészetet hoztak létre. Aztán a tenyészet sejtjeit nyugalmi állapotba hozták, hogy majd ugyanebben az állapotban olyan petesejtbe juttassák, amelybôl elôzôleg eltávolították a sejtmagot. A következô lépésben a befogadó sejtmag nélküli petesejt citoplazmáját és a donor emlôssejtet elektromos impulzussal egyesítették, amely ezzel aktiválódott, osztódni kezdett és elindult az embrionális fejlôdés. folyamata. Az így létrehozott embriót végül álvemhes nôstény petevezetôjébe ültették. Az eredmény: néhány hónap múlva megszületett Dolly, a Föld elsô klónozott emlôsállata.

A klón genetikailag egységes sejtek populációja, amely egyetlen sejt osztódásából keletkezik. Klónozáskor tehát az adott egyed egyetlen sejtjébôl kiindulva hoznak létre (genetikailag egységes) utódokat. A kiinduló sejt lehet egyetlen baktérium-, gomba-, moszat- vagy szövettenyészetbôl származó sejt, de lehet a magasabb rendû növények vegetatív szaporító szervének sejtje is.

A növények testi sejtjébôl kiindulva már számos növényfaj esetében sikerült reprodukálni a teljes növényt, az egysejtû és gerinctelen állatok körében viszont eleve elterjedt ez az ivartalan szaporodási mód. Kétéltûekkel is végeztek klónozásos kísérleteket, melyek során [1] a tudósok arra keresték a választ, hogy a különbözô differenciáltsági állapotban levô sejtek magjai azonos fejlôdési potenciállal rendelkeznek-e vagy sem, s létrehozhatók-e életképes utódok úgy, hogy ehhez már egy bizonyos fejlôdési stádiumba lépô (determinálódott) sejt magját használják fel. A determináció folyamatát úgy értelmezték, hogy az embrionális fejlôdés során egyre több gén, géncsoport mûködése kerül gátlás alá a differenciálódó sejtekben. Ezzel egyre jobban beszûkül a sejtek elôtt az a lehetôség, hogy belôlük még "bármi" kifejlôdhessen (csökken a potenciájuk), s így egyre inkább specializáltabb formába kerülnek. Eközben, kivéve bizonyos immunsejteket, a DNS-tartalom azonos marad a fejlôdés során valamennyi sejtben. A sejtmagokban jelen van az egész szervezet létrehozásához és mûködéséhez szükséges információ, ennek jelentékeny része azonban (ami nem az adott differenciált sejtre jellemzô tulajdonságot kódol) gátlás alatt van. Azt feltételezték, hogy a citoplazma képes újraaktiválni ezeket a gátolt géneket.

Amikor a kétéltûek petesejtjének sejtmagját besugárzással tönkretették (enukleálták), az barázdálódott ugyan, de ezt követôen elpusztult. Ha mesterségesen, tûszúrással aktivált, enukleált békapetesejtbe hólyagcsíra- (blasztula) állapotban levô, a békaembrió animális sejtjének pólusán elhelyezkedô sejtmagot ültették be, akkor az így kapott embriók egy része normálisan fejlôdött tovább és ép ebihalak alakultak ki belôlük. Ezek a kísérletek azt bizonyítják, hogy a fejlôdés korai fázisában a sejtmagban semmiféle irreverzibilis folyamat nem zajlik le. Az idôsebb embriókból vett sejtmagok azonban már csak igen alacsony százalékban voltak képesek az embrionális fejlôdés irányítására, életképes utódokat nem kaptak. Ezek az eredmények viszont azt igazolják, hogy az idegcsíra kialakulásának (neuruláció) idejétôl kezdôdôen sok sejt magstruktúrájában olyan irreverzibilis változások játszódnak le, amelyeket a citoplazmában található faktorok önmagukban nem képesek visszaállítani, reprogramozni.

A 90-es évek kezdetétôl emlôsállatok embrióinak felhasználásával nagyon sok munkacsoport folytatott klónozásos kísérleteket. A kutatók a klónozáshoz kezdetben egy igen egyszerû, könnyen kivitelezhetô módszert alkalmaztak: 32-128 sejtes embriókat vágtak félbe, s így egypetéjû ikreket hoztak létre [2]. Mikromanipulátor segítségével megoldották ugyan a szedercsíra-állapotban levô embriók négyfelé osztását, de ennél több darabra vágott embrióból, illetve fejlettebb állapotban levô embriódarabokból már nem sikerült életképes utódokat létrehozni (1. ábra).

Az embriósokszorozás járhatóbb útjának látszott ezért a sejtmagátültetéses módszer, amivel elméletileg nagyobb számban lehet ikreket elôállítani. E kísérletek során az úgynevezett befogadó (recipiens) petesejtbôl kipipettázzák a sejtmagot és a sarki testet, majd citoplazmájába beinjektálták egy másik sejt (donor) sejtmagját vagy a teljes sejtet. Azután a két sejt citoplazmáját elektromos impulzus segítségével összeolvasztották (fuzionáltatták). Az elektromos sokk egyúttal aktiválta is a petesejtet: az embrió osztódni kezdett, s elindult a normális embrionális fejlôdés (2. ábra).

Az emlôsállatok klónozására tett próbálkozások változatos eredményeket hoztak. Nyolcsejtes állapotnál fejlettebb egérembriókból izolált sejteket (blasztomereket), illetve az embriócsomóból származó sejteket vagy ES-sejteket (lásd késôbb) felhasználva nem kaptak élô utódokat [3]. Szarvasmarha- és juhembrióból kiindulva több sikerrel jártak. Korai szedercsíra-állapotú (morula) sejtekbôl is sikerült életképes utádokat kapni, sôt a szarvasmarha- és a juhembrió embriócsomójából származó, rövid ideig tenyésztett sejtek enukleált petesejtbe való beinjektálása is sikerrel járt [4]. A siker oka nem az volt, hogy a felhasznált sejtek totipotensek voltak, azaz képesek voltak teljes szervezetet létrehozni, hanem az, hogy találtak egy olyan módszert, amelynek segítségével a donor sejt sejtmagja és a befogadó sejt citoplazmája között jobb lett az összhang. Ian Wilmut és munkatársai a skóciai Roslin Intézetben bebizonyftották, hogy a donor és a recipiens sejtek állapotának összehangolása elengedhetetlenül szükséges [5].

3. ábra A sejtciklus fázisai

Az emlôsöknél a legtöbb esetben a felhasznált sejtmag a sejtciklus S- vagy G2-fázisában volt, ami nem felel meg a metafázis-II állapotban levô petesejt citoplazmájának (3. ábra). Wilmut és munkatársai G0-fázisban levô donor sejteket alkalmaztak, így jobb lett a szinkron a beültetett sejtmag és a recipiens sejt citoplazmája között, ezáltal pedig jelentôs mértékben megnövekedett a reprogramozás hatékonysága.

A 90-es években hazánkban is elkezdôdtek a klónozásos kísérletek. A szarvasmarha- és juhklónozás területén szép eredményeink születtek. Mosonmagyaróváron már 1984-ben hoztak létre iker bárányokat. Embriószétválasztásos módszerrel sikerült megnégyszerezniük a birkaembriókat. Az 1990-es években azonban áttértek a sejtmagátültetéses kísérletekre. Négy klónozott juhot sikerült létrehozniuk.

A Gödöllôi Mezôgazdasági Biotechnológiai Kutatóközpont Állatbiotechnológiai Intézetében az 1990-es évek elejétôl kezdôdôen szintén zajlottak sejtmagátültetéses kísérletek in vitro módszerrel létrehozott szarvasmarha-embriók sejtjeinek felhasználásával. Szedercsíra állapotú (morula), klónozott embriókat sikerült létrehozniuk.

A sejtmagátültetéses kísérletek megteremtik az elvi lehetôségét a nagyszámú, genetikailag azonos állatpopulációk létrehozásának. Az állatbiotechnológia területén azonban nagyobb jelentôséggel bírna, ha genetikailag módosított sejttenyészetekbôl kiindulva sikerülne életképes utódokat létrehozni. Wilmut kutatócsoportjának 1996 elejére ezt is sikerült megvalósítania, melyhez embrionális eredetû ôs-sejtvonalból (az ES-sejtvonalból) származó donor sejteket használtak fel [4].

A hólyagcsíra állapotban levô emlôsembrió (blasztociszta) kétféle sejttípusból áll. A blasztociszta falát képezô külsô, úgynevezett trofoblaszt réteg sejtjeibôl (amelyek a magzat méhlepényének, illetve külsô magzatburkának képzésében vesznek részt) és a blasztociszta embriócsomójának (inner cell mass, ICM) sejtjeibôl. Ebbôl alakul ki maga az embrió, illetve a belsô magzatburok. A pluripotens embrionális eredetû ôs-sejtvonalak a blasztociszta embriócsomójából származtathatók (4. ábra).

Ha a blasztocisztát embrionális eredetû fibroblaszt rétegre helyezzük, a blasztociszta letapad a fibroblaszt rétegre, a külsô trofoblaszt réteg sejtjei pedig óriás, sokmagvú sejtekké alakulva ránônek arra, míg az ICM-sejtjei szorosan együtt maradnak, s az ún. ICM-csomót hozzák létre. Ha a blasztocisztát hagynánk tovább fejlôdni, az ICM-csomó sejtjei differenciálódni kezdenének. Ha azonban az ICM-csomót izoláljuk a tenyészetbôl, s ezt tripszin-cseppben kisebb aggregátumokká disszociáltatjuk, és ezeket az aggregátumokat friss fibroblaszt rétegre helyezzük, ezek a kis csomók letapadnak, s különbözó morfológiájú kolóniákat hoznak létre. Olyan kolóniák is létrejönnek, amelyek továbbra sem differenciálódó, az ICM sejtjeihez hasonló sejtekbôl állnak. Ezeket a kolóniákat ismét izolálni lehet a tenyészetbôl. A kolóniákat aztán tripszin-cseppben sejtjeire disszociáltatjuk, s ezt a sejtszuszpenziót helyezzük friss fibroblaszt sejtrétegre, azaz átpasszáljuk. Ha a keletkezó újabb kolóniák mind egyformák lesznek, s a további passzálások során sem változik meg a morfológiájuk (kerekded, szorosan kapcsolódó, nagy sejtmagvú, apró sejtekbôl épülnek fel), akkor mondhatjuk azt, hogy rendelkezésünkre áll egy pluripotens embrionális eredetû ôs-sejtvonal. Az ES-sejtvonalak optimális tenyésztési körülmények mellett állandóan osztódó, nem differenciálódó sejtekbôl épülnek fel. Az ES-sejteket le lehet fagyasztani, s így a folyékony nitrogénben gyakorlatilag korlátlan ideig megôrizhetôk. Ha a tenyésztési feltételek megváltoznak, az ES-sejtek a legkülönbözôbb típusú sejtekké képesek differenciálódni. Ha az ES-sejteket hólyagcsíra állapotban levô gazdaembrióba injektáljuk vagy két nyolcsejtes gazdaembrióval aggregáltatjuk, kiméra utódokat kaphatunk. A kimérák minden szövetében, szervében megtalálhatók lesznek az ES-sejtvonalból származó sejtek, így az ivarsejtek között is.

Az 1990-es évek során hörcsög-, sertés-, szarvasmarha-, amerikainyérc-, nyúl-, majom-, patkányembrióból kiindulva is alapítottak ES-jellegû sejtvonalakat. Ezek a sejtvonalak folyamatosan passzálhatók, tenyészetben fenntarthatók, megtartják differenciálatlan fenotípusukat és az ES-sejtvonalak sejtjeire jellemzô morfológiát mutatnak.

Ma két olyan módszer ismert, amely segítségével sejtvonal eredetû utódokat lehet kapni ES-sejtekbôl kiindulva. Az elsô esetben egér-ES-sejtvonal sejtjeit tetraploid gazdaembrióval aggregáltatva, a másikban pedig birkaembrióból származó ES-sejtet enukleált petesejtbe injektálva kaptak teljesen sejtvonal eredetû állatokat.

Nagy elôretörést jelentett az ES-sejtvonalakból kiinduló klónozásos kísérletek területén az, amikor Nagy András kutatócsoportjának sikerült sejtvonal eredetû, életképes egereket létrehoznia. Még 1989-ben, az ELTE Gödi Embriológiai Laboratóriumában elindultak ezek a klónozásos kísérletek. Kétsejtes állapotban levô egérembrió két sejtjét fuzionáltatva (elektrofúzióval) tetraploid egérembriókat hoztak létre. Ezeket a tetraploid embriókat használták fel gazdaembrióként. Két-két tetraploid gazdaembriót aggregáltattak egy-egy 15 ES-sejtet tartalmazó ES-csomóval. A két tetraploid gazdaembrió és az ES-sejtcsomó egyetlen közös aggregátummá állt össze, majd a normális embrionális fejlôdés menetének megfelelôen a morula állapotú embrióból hólyagcsíra állapotú embrióvá differenciálódott. Az így kapott ES-kiméra embriókat álvemhes nôstény méhébe ültették. A világra jött állat sejtvonal eredetû volt, de születése után néhány órával elpusztult (5. ábra).

Ezt követôen számos új egér-ES-sejtvonalat alapítottak és próbáltak ki klónozásos kísérletekben, míg végül az R1 elnevezésû sejtvonalat felhasználva sikerült (ES-sejtvonal eredetû) életképes állatokat elôállítaniuk. Ma szinte az egész világon ismert ez az R1-sejtvonal, s nagyon sok laboratóriumban ebbôl a sejtvonalból kiindulva állítanak elô transzgénikus ES-sejtvonalakat.

Campbell, Wilmut és munkatársai 1996-ban tudósítottak arról, hogy birka ES-sejtvonal sejtjeit enukleált birkapetesejtbe injektálva életképes sejtvonal eredetû utódokat kaptak, amelyhez a sejtmag-átültetéses kísérletekhez alkalmazott módszert használták fel. A recipiens petesejtbôl eltávolították a metafázis-II állapotban levô kromoszómákat, a poláros testet és a poláros test közvetlen közelében levô citoplazma egy kis mennyiségét is. Ezt követôen birka-ES-sejtet injektáltak az enukleált petesejtbe, majd elektromos impulzussal segítették elô a recipiens petesejt és a donor ES-sejt fúzióját. Ez az elektromos impulzus egyben aktiválta is a petesejtet; s ezzel kezdetét vette a normális embrionális fejlôdés. Az így kapott egysejtes embriókat, ill. az in vitro blasztocisztává fejlôdött embriókat anyaállatba ültették. Sejtvonal eredetû életképes utódokat kaptak. 1997 februárjában ugyanez a kutatócsoport egy újabb publikációt jelentetett meg, amely az egész világot bejárta. A szenzációt ez esetben az jelentette, hogy egy felnôtt állat testi sejtjébôl, pontosabban egy hatéves birka emlôszövetébôl kivett sejtbôl hozták létre a nôstény állat genetikai másolatát (6. ábra).

Wilmut és munkatársai háromféle kísérletet végeztek, az elsôben ES-sejteket, a másodikban a birkaembrió fibroblaszt sejtjeit; a harmadikban pedig felnôtt állatból izoláltak emlôssejteket. Aztán mindegyik sejtbôl egy-egy sejttenyészetet hoztak létre. A sejteket felszaporították, majd a sejttenyésztô médiumban levô FCS (fetal calf serum) szintjét 0,5%-ra csökkentették. Az alacsony szérumszint hatására a sejtek G0, azaz nyugalmi fázisba kerültek. A sejttenyészetekbôl azután egy-egy ilyen nyugalmi fázisban levô sejtet izoláltak. Ezeket a donor sejteket olyan petesejtbe injektálták, amelyekbôl elôzôleg eltávolították a sejtmagot és a sarki testet. A donor sejt és a befogadó recipiens petesejt citoplazmája elektromos impulzus hatására fúzionált, majd az embrió osztódni kezdett. Ezt követôen az embriót hormonálisan elôkészített nôstény állat méhébe ültették. Mindhárom sejttípus esetében sikerült életképes utódot kapniuk.

Az ES-sejtek, illetve az embrionális eredetû fibroblaszt sejtek felhasználásához az utódállatok egy ismeretlen tulajdonságú és fenotípusú embrió genotípusát hordozták. Az emlôsejt-tenyészetbôl kiindulva kapott utód, Dolly azonban egy ismert tulajdonságú anyaállat genetikai másolata volt, az elsô olyan állat a világon, amely felnôtt állat testi sejtjébôl jött létre. Dolly azonban nem tekinthetô az emlôsejtet adó anyajuh hasonmásának!

Az egypetéjû ikrekkel folytatott kísérletekbôi is kiderült, hogy nincs két tökéletesen egyforma iker, így az sem várható, hogy klónozással tökéletesen egyforma utódokat lehessen létrehozni. A genetikailag azonos ikerállatokat az embrionális fejlôdés során, s a megszületést követôen is eltérô környezeti hatások érhetik. A sejtmagátültetések során pedig nemcsak a donor sejt nukleuszában levô genetikai információ kerül bele az utódba, hanem a recipiens petesejt citoplazmájában maradó mitokondriumokban levô mitokondriális DNS is. Az emlôsejtek genetikai anyaga a sejtek élete során sérülhetett, különbözô mutációk jöhettek létre, így az emlôsejt maga sem tekinthetô már az anyai genom tökéletes másolatának.

Ezért vetôdhet fel a kérdés: hány éves is Dolly, ha a recipiens petesejt citoplazmája egy idôsebb sejttel fuzionált? Vajon melyik alkotórész hatása érvényesül és hány évig fog élni Dolly? Ezekre a kérdésekre Dolly megfigyelése adhatja csak meg a választ, ami felbecsülhetetlen információkat nyújthat még az öregedési folyamat kutatóinak.

Ez a leírt módszer még korántsem tekinthetô tökéletesnek. Összesen 277 petesejtet használtak fel, míg egyetlen életképes utódot sikerült létrehozniuk. Az emlôsejt-tenyészetben háromféle sejttípust figyeltek meg a tudósok: emlôhámsejteket, kötôszöveti sejteket, és elôfordultak totipotens ôssejtek is. Wilmut és munkatársai nem tudták pontosan megállapítani, hogy melyik sejttípusból is származik Dolly. Elképzelhetô, hogy kivételes szerencse folytán egy ôssejt jellegû sejtet találtak, s más szövetek, sejtek esetében az általuk ismertetett módszer nem használható.

A birka- és szarvasmarha-embriók korai embrionális fejlôdése is eltérô más emlôsök embrionális fejlödésétôl, így az egér és ember embrionális fejlôdésétôl is. Szarvasmarha- és juhembriók esetében 16 sejtes állapot után történik csak elôször átírás (transzkripció) az embrió saját DNS-éról, az ezt megelôzô idôszakban a citoplazmájában felhalmozott anyagokat használja fel. Más fajok embrióiban ennél jóval hamarabb, már kétsejtes (egér), illetve korai nyolcsejtes állapotban (nyúl, majom, ember) megtörténik a transzkripció [7].

Az elôbbiekben említett gondolatok is alátámasztják azokat a megállapításokat, amelyek szerint az ember testi sejtjeibôl kiinduló klónozás, a "szép új világ" utópiájának megvalósulása nem várható a közeljövôben.

Számos országban már napjainkban is tiltják az ember klónozását célzó kísérleteket, s több világszervezet állásfoglalása szerint sem fogadható el az ember klónozása. Maga Ian Wilmut is azt mondta: "Embert klónozni embertelen lenne." Az emberiség nagy erénye éppen annak sokféleségében rejlik.

A juhok klónozása figyelemre méltó tudományos eredmény, amelynek komoly haszna lehet az orvostudományban és a mezôgazdaságban is. Az ES-sejttenyészetekbôl származó sejtek alkalmazása pedig új Iehetôségeket biztosít szelektált, uniformizált, genetikailag azonos állatok elôállitására. A klónozott állatok létrehozása hatalmas elôrelépést jelenthet mind az alapkutatás, mind a biotechnológiai és agrárkutatások területén. A transzgénikus ES-sejtvonalak elôzetes szelektálásának lehetôsége olyan új módszert biztosít a tudomány számára, amely felhasználásával egy teljes populáció gyors és célzott genetikai módosítása válik lehetôvé. A magátültetéses kísérletek tökéletesítésével új lehetôség nyílt az embriológusok és a molekuláris genetikusok számára. Például az, hogy megismerjék az embrionális fejlôdés, a sejtdifferenciálódás, illetve a sejtek öregedése során zajló változások molekuláris mechanizmusának fôbb lépéseit (mint például genom-imprinting, illetve a kromoszómarövidülés folyamata), amelyek a szomatikus sejtekben zajlanak le.

[1] Gurdon, J. B. (1975) J. Embryol. Exp. Morph. 34, 93-112.
[2] Willadsen, S. M. (1986) Nature 320, 63-65.
[3] Tsunoda, Y. (1993) Reprod. Fert. 98, 537-540.
[4] Campbell (1996) Nature 380, 64-66.
[5] Wilmut, I. (1997) Nature 385, 810-813.
[6] Nagy, A., (1990) Development 110, 815-821.
[7] Crosby, I. M. (1988) J. Reprod. Fert. 82, 755-769.

animális sejtek: a petesejt szikben szegény citoplazmájú pólusánál kialakuló sejtek

blasztociszta: hólyagcsira állapotú embrió

blasztomerák: barázdálódási sejtek

blasztula: hólyagcsíra állapotú embrió

determináció: a fejlôdés során az a folyamat, amelyben eldôl, hogy a sejtek milyen irányba differenciálódhatnak

elektromos fúzió: elektromos impulzus hatására összeolvad két barázdálódási sejt

ES-sejtvonal: embrionális eredetû ôssejtvonal

fenotípus: az egyed külsô és belsô tulajdonságainak az összessége

gasztruláció: a barázdálódáskor létrejött sejtek a gasztruláció során végleges helyükre kerülnek, kialakulnak a különbözô csíralemezek, amelyekbôl kiindulva megindulhat a szervképzôdés folyamata

genom-imprinting: bizonyos gének esetében a DNS által kódolt genetikai információ módosulhat, egy a DNS-szálra másodlagosan rátevôdô nem genetikai információtól (például a DNS metilálódása által)

genotípus: a génekben tárolt genetikai információk összessége

in vitro tenyészetek: az eredeti környezetükbôl kiszakítva tanulmányoznak biológiai folyamatokat, szövet-, szem-, sejttenyészeteket felhasználva

inner cell mass: a hólyagcsíra állapotú embrió embriócsomója

irreverzibilis: visszafordíthatatlan

kiméra: különbözô eredetû sejtpopulációból felépülô egyed

klón: egyetlen egyedbôl ivartalan úton származó genetikailag egységes utódok összessége

mikromanipulátor: olyan készûlék, amely alkalmas mikronos méretû pipetták, kések mozgatására

mitokondrium: az oxidatív foszforiláció szolgálatában álló energiatermelô sejtszervecske

morula: szedercsíra állapotú embrió

neuruláció: a nerula (idegcsíra) kialakulásának folyamata

passzálás: sejttenyészetek feltripszinezése után kapott sejtszuszpenzió friss, tápláló sejtrétegre helyezése

pluripotens sejtek: az embrionális fejlôdés során szükséges majdnem minden információt tartalmazó sejtek

poláros testek: sarki testek, a petesejt érése során kizáródó sejtek

reprogramozás: a már egyszer elfedett információ ismét felhasználhatóvá válása

tetraploid embrió: a kétsejtes embrió két diploid sejtjének összeolvadását követôen Iétrejövô négyszeres kromoszóma számú sejtekbôl álló embrió

totipotens sejtek: az embrionális fejlôdés során szükséges minden információt tartalmazó sejtek

transzkripció: DNS-rôl történô RNS-átírás folyamata

Vissza a tartalomjegyzékhez